Ostatnio mocno koncentrowałem się na wyprowadzeniu azotanów na właściwy poziom. Jak pisałem w metodą, którą ja wybrałem była VSV/wódka. Działanie tej metody opisałem w osobnym poście. Jednak sama VSV jest motorem cyklu azotowego, niezwykle ważnego w naszych akwariach. Jakże powszechne są posty w stylu: dojrzewanie, jak zbić azotany?, jak się pozbyć glonów? Wspólnym mianownikiem tych postów jest oczywiście cykl azotowy i zawartość słynnych już azotanów w naszych akwariach. Żeby jednak wiedzieć jak usprawnić obieg azotu w akwarium musimy poznać jego mechanizmy. W trakcie pogłębiania wiedzy na ten temat, na jednym for natknąłem się na artykuł profesora Marco Colasanti z Uniwersytetu w Rzymie. Postanowiłem przetłumaczyć cały artykuł. Artykuł jest przetłumaczony dokładnie, jednak żeby go troche uprościć ominąłem te zagadnienia, które nie mają jakby znaczenia z naszego punktu widzenia, a które dość skutecznie komplikują cały obraz. Ze względu na to ze jednak cykl azotowy jest nierozerwalnie złączony z procesami biochemicznymi, dodałem gdzie, nie gdzie, drobne własne wyjaśnienia żeby uczynić tekst bardziej zrozumiałym. Przetłumaczyłem też bardziej skomplikowane rysunki. Tłumaczenie robione było na raty i już dawno powinienem je umieścić na forum, jednak ze względu na objętość trochę brakowało czasu. Jednak ostatnia praca Kubaaasa zmotywowała mnie do ukończenia tego tłumaczenia. Link do oryginału
Cykl azotowy: nowe kierunki rozwoju i nowe perspektywy
Do tej pory uznaliśmy cyklu azotu, jako szereg reakcji liniowej zawartych w okręgu. Ale czy naprawdę tak wygląda ten cykl? Ważne odkrycia w tych ostatnich latach drastycznie zrewolucjonizowały tą koncepcję. W tym poście spróbuję wyjaśnić niektóre z tych badań naukowych, w taki sposób, aby uczynić to złożone zagadnienie, zrozumiałe.
Spis treści
1. Podstawy cyklu azotowego
2. Wiązanie azotu i amonifikacjia
3. Nitryfikacja
4. Denitryfikacja
5. Nowe kierunki rozwoju i nowe perspektywy
6. AOA Bakterie utleniające amoniak
7. DNRA: Denitryfikacja w warunkach tlenowych
8. ANAMMOX: utlenianie amoniaku w warunkach beztlenowych
Cyklu azotowy odgrywa bardzo istotną rolę w zamkniętym środowisku, jakim jest akwarium. Ze względu na jego obecność jest możliwe utrzymywanie aktywności ryb i bezkręgowców, w małych zbiornikach, dlatego jest ważne, aby go zrozumieć, głównie w aspekcie zdrowia i rozwoju form życia, które mamy pielęgnować.
Kilka lat temu sądzono, że cykl azotu w jego złożoności, był procesem linowym. Jednakże najnowsze odkrycia naukowe znacznie zrewolucjonizowały naszą wiedzę o procesach azotowych i mikroorganizmów zaangażowanych w te procesy. W rzeczywistości całkowity obieg azoty w środowisku, w szczególności morskim, został rozbudowany o trzy główne procesy:
1. utlenianie amonu przez określonej grupy mikroorganizmów, archaeabacteria (AOA);
2. beztlenowa redukcja azotanów do jonów amonowych (DNRA);
3. procesy utleniania beztlenowych amonu (ANAMMOX).
W pierwszej części niniejszego postu, podejmę się przeglądu zasadniczych i bardziej dominującym aspektów cyklu azotu: procesy transformacji, główne składniki (azot atmosferyczny, amoniak i jony amonowe, azotyny, azotany) i rolę odgrywaną przez poszczególne gatunki bakterii.
Ogólny zarys cyklu azotu
Azot (N) jest istotnym składnikiem pokarmowym dla wszystkich organizmów, jest najważniejszym składnikiem białek, witamin, DNA i jest ważny w strukturach biochemicznych oraz dla procesów definiowania życia.
Azot występuje w różnych stanach utleniania i w wielu formach chemicznych, które szybko są konwertowane przez drobnoustroje zarówno na ziemi i w morzach.
W środowisku morskim azotu jest obecny w pięciu formach:
1. Gazowy azot (N2), stabilne cząsteczki, które wymagają skomplikowanych procesów enzymatycznych (niektóre rodzaje bakterii) dla utrwalenia i późniejszego wykorzystania;
2. Amoniak / jony amonowe (NH4+), najbardziej zredukowana forma azotu i najbardziej powszechna w warunkach beztlenowych;
3. Jon azotanowy (NO3-), najbardziej utleniona postać azotu i najpowszechniejsza w warunkach tlenowych
4. Pyły azotu organicznego (PAO), postać organiczna azotu dominująca w osadach;
5. Rozpuszczony azot organiczny (RAO), mieszanina cząsteczek o różnym stopniu złożoności
Złożona sieć reakcji łączy te formy azotu w procesy, które jako całość, są nazywane cyklem azotowym (rysunek 1). Największe źródło azotu występuje w formie gazu obojętnego N2 , reprezentujące 78% atmosfery. Niewielka część azotu atmosferycznego N2 jest wiązana przez pewne bakterie i jest redukowana do jonów amonowych (NH4+), które mogą być łatwo przyswajane przez inne organizmy. W środowisku morskim, które zamieszkane jest przez pewne szczepy bakterii, jon amonowy jest szybko utleniony do jonu azotanowego w warunkach tlenowych (nitryfikacja). Następnie jon azotanowy jest redukowany ponownie do gazu N2 w warunkach beztlenowych (denitryfikacja), tym samym następuje zakończenie cyklu (rysunek 1).
Rysunek 1. Ogólnie znany schemat cyklu azotu w wodzie morskiej.
Wiązanie azotu i amonifikacja
Wiązanie azotu
Biologiczne wiązanie azotu może być przedstawione w postaci następującego równania chemicznego:
N2 + 8 H+ + 6e- = 2NH4+
Ogólnie rzecz biorąc oznacza to, że jedna cząsteczka azotu atmosferycznego, w warunkach beztlenowych, wiążąc 8 kationów wodoru i 6 elektronów tworzy dwa aniony amonowe. Warto zauważyć ze proces ten podnosi pH wody.
Zwróćmy też uwagę, że ostatecznie, ilość jonów amonowych w wodzie jest w równowadze z amoniakiem (NH3) w oparciu o następujące równanie:
NH3 + H2O = NH4+ + OH-
Stężenie obu składników, czyli amoniaku i jonu amonowego zależy w głównej mierze od pH środowiska. Czyli im wyższe pH tym więcej toksycznego amoniaku. Im niższe pH tym więcej mniej toksycznych jonów amonowych. Jak widać na kolejnym rysunku w normalnej wodzie morskiej przeciętna ilość jonów amonowy to 82-97% a amoniaku 3-18%. Im bardziej podnosimy pH tym azot przyjmuje bardziej toksyczna formę.
Jak stwierdziliśmy wyżej, azot atmosferyczny N2, zanim zostanie wbudowany w biologiczne struktury musi najpierw być zredukowany do NH3/NH4+ poprzez szereg reakcji nazywanych biologicznym wiązaniem azotu. Takie reakcje są katalizowane przez enzym zwany nitrogenazą, który jest obecny w niektórych bakteriach wiążących azot należących głównie do sinic (Cyanobacteria). Jedną z właściwości tego enzymu jest to, że w obecności tlenu cząsteczkowego (O2) staje się on nieodwracalnie zablokowany. Dochodzi tu do pewnego paradoksu ponieważ w warunkach naturalnych wiązanie N2 następuje ogólnie rzecz biorąc w warunkach tlenowych. Jak wiec to możliwe? W rzeczywistości sinice mają możliwość aktywowania działania nitrogenazy nawet w obecności tlenu powstającego w procesie fotosyntezy. Niestety mechanizm ten nie jest jeszcze zbadany. W środowisku morskim bakterie wiążące azot (np. z rodzajów Clostridium i Azobacter ) znajdują się zarówno w postaci wolnej i w symbiozie z innymi organizmami np. z gąbkami.
Z pewnością biologiczne procesy wiązania azotu są niezwykle ważne w morzach i oceanach, ale mają ograniczoną rolę w akwariach. A skąd się bierze azotu w akwarium?
Rysunek 2. Stężenie zależne od pH NH4+ i NH3 w wody morskiej
Głównym źródłem azotu jest pożywienie zarówno ryb jak i bezkręgowców, szczególnie w formie białka i pojedynczych aminokwasów, zakładając, że są one bezpośrednio podawane do zbiornika.
Chemiczny rozpad aminokwasów prowadzi do uwolnienia amoniaku do zbiornika. W jaki sposób? Z jednej strony białka trawione przez ryby czy inne organizmy rozpadają się na pojedyncze aminokwasy. Z kolei aminokwasy mogą służyć do tworzenia nowych białek w obrębie organizmu lub też mogą być utleniane w celu dostarczania energii. Rozpad aminokwasów przez organizmy prowadzi do eliminacji różnorodnych produktów ubocznych. Na przykład ryby uwalniają azotu jako amoniak, podczas gdy większość organizmów może uwolnić go w postaci kwasu moczowego (ptaki, gady) lub mocznika (ludzie). Z drugiej strony w obecności dużego ładunku organicznego, białka i aminokwasy jako odpady lub wydaliny, sedymentują w osadach organicznych (ogólnie wszystkim znany syfek na dnie) i są rozkładane w procesie nazywanym amonifikacjią, przez bakterie, które uwalniają amoniak do wody przez rozkład detrytusu.
Nitryfikacja
Nitryfikacja występuje w dwóch różnych etapach:
1. utlenianie amonu do azotynów i
2. utlenianie azotynów do azotanu .
1) W pierwszym etapie, jony amonowe są utleniane do azotynów w dwóch etapach:
1. Pierwszym krokiem powstanie hydroksyloaminy w reakcji enzymatycznej, z pomocą O2 jako utleniacza:
2NH4+ + OH2O2 = 2NH + 2 H+
2. W drugim etapie hydroksyloamina jest utleniana do azotynów przez inny enzym:
2NH2OH + 2O2 H = 2H+ + 2 H2O 2NO2-
2) drugi etap: utlenianie azotynów do azotanów, pod wpływem enzymów, kończy proces nitryfikacji:
2NO2- + O2 = 2NO3-
Proces nitryfikacji w obecności tlenu obrazowany jest za pomocą ogólnego wzoru (patrz rysunek 1):
2NH4+ + 4O2 = 4 H+ + 2 H2O 2NO3-
Pamiętajmy jednak, że jest to wzór mocno uogólniony i w rzeczywistości składa się na szereg przemian.
Pojawia się pytanie:, Co tym wszystkim steruje? Ogólnie za proces metabolicznych przemian azotu odpowiadają dwie grupy bakterii
1. bakterie, które utlenienia amoniak (bakterie utleniające amoniak), nazywane również bakteriami azotawymi. Należą głównie do rodzajów Nitrosococcus i Nitrosomonas;
2. bakterie, które utleniają azotyny (bakterie utleniające azotyny) nazywane również bakteriami azotowymi. Tworzą one część gatunków Nitrobacter, Nitrococcus i Nitrospira .
Bakterie azotowe są aerobami i chemoautotrofami, ponieważ bezpośrednio używają CO2 jako źródło węgla, podczas gdy substancje organiczne mogą być dla nich toksyczne.
Denitryfikacja
Zastanawiałem się czy tłumaczyć dokładnie cały proces denitryfikacji, jako ze jest bardziej skomplikowany niż dwuetapowa nitryfikacja. Zdecydowałem się ominąć opis biochemiczny skupiając się na ogólnych procesach chemicznych. Składają się one z czterech etapów polegających na redukcji poszczególnych wartościowości azotu (wartościowość azotu podana jest w nawiasach)
1. Redukcja azotanów (5) do azotynów ( 3). Ta reakcja jest katalizowana przez enzym, który istnieje w błonie komórkowej bakterii.
2NO3- + 4 H+ + 4e- = 2NO2- + 2 H2O
2. Redukcja azotynów ( 3) do tlenku azotu ( 2). Azotyny, pod wpływem kolejnego enzymu, uwalniają tlenku azotu (NO).
2NO2- + 4 H+ + 2e- = 2NO + 2 H2O
3. Redukcja tlenku azotu ( 2) do podtlenku azotu (1) (to ten gaz rozweselający). Następuje dalsza redukcja enzymatyczna NO do podtlenku azotu N2O.
2NO + 2 H+ + 2e- = N2O + H2O
4. Redukcja podtlenku (+ 1) do azotu N2. Ostatni etapem reakcji w procesie denitryfikacji jest redukcja podtlenku azotu do azotu cząsteczkowego w postaci gazowej. Na tej reakcji należy zakończyć proces denitryfikacji zawarty w cyklu azotu.
N2O + 2 H+ + 2e- = N2 + H2O
Denitryfikacja jest jednym z kluczowych procesów w obrębie cyklu azotowego. Ogólny wzór reakcji opisujący skrótowo cały proces wygląda następująco:
2NO3- 12 H+ + 10e- = N2 + 6 H2O
Denitryfikacja jest głównie procesem heterotroficznym i występuje w warunkach beztlenowych. Wiele szczepów bakterii nazywanych ogólnie bakteriami denitryfikacyjnymi jest w stanie przeprowadzić całą sekwencję tych reakcji, zakładając, że posiadają wystarczający zapas enzymów.
Bakterie denitryfikacyjne są w stanie oddychać (czyli czerpać energie) beztlenowo przy użyciu azotanu w miejsce tlenu. Bakterie te posiadają specjalne enzymy (rysunek 3), który umożliwia umożliwiają ten proces, w przypadku braku tlenu.
Niektóre gatunki bakterii ze szczepów Pseudomonas, Thiobacillus, Paracoccus i Naisseria, są uważane za bakterie denitryfikujące
Rysunek 3. Proces denitryfikacji w błonach cytoplazmatycznych bakterii.
Nowe kierunki rozwoju i nowe perspektywy
Poprzedni opis reprezentuje scenariusz dobrze znanych przez długi czas. Jednak w trakcie ostatnich lat nasze badania dotyczące cyklu azotowego drastycznie zmieniły spojrzenie na ten proces kwestionując zasadę zamkniętego procesu liniowego. Było to spowodowane technikami badan, które nie tylko pozwoliły na zrozumienie reakcji chemicznych, ale również na odkrycie nowych mikroorganizmów, które powodują, że cykl azotowy jest jeszcze bardziej złożony niż pierwotnie zakładaliśmy (rysunek 4). W drugiej części tego postu spróbuję wyjaśnić niektóre ważne zmiany w tradycyjnym cyklu azotowym:
1. Utlenianie amoniaku przez określonej grupy mikroorganizmów, archaeabacteria (AOA)
2. Beztlenowa redukcja azotanów do amoniaku (DNRA)
3. Beztlenowe procesy utleniania amoniaku (ANAMMOX)
(AOA) Archaeabacteria - bakterie utleniające amoniak
Niedawno zostały zidentyfikowane nowe organizmy uczestniczące w cyklu azotowym, archaeabacteria,. Pomimo pewnych niejasności, co do ewolucji tych organizmów, wiemy, że archaeabacterie (zwane też Archeowcami lub ogólnie AOA) w połączeniu z organizmami zawierającymi komórki jądrowe (Eucariota), były podstawą ewolucji u istot żywych.
Archaeabacteria, podobnie jak bakterie, składają się z pojedynczej komórki bez jądra i w przeszłości były klasyfikowane wraz z bakteriami jako prokaryota. Na podstawie analizy DNA archaeabacteria zostały zaliczone do trzech typów: Crenarchaeota, Euryarchaeota i Korarchaeota. Bakterie Euryarchaeota są najbardziej rozpowszechnione i obejmują m.in. bakterie produkujące metan oraz organizmy słonolubne - halofile. Bakterie Crenarchaeota obejmują bakterii termolubne, zamieszkującą np. gorące źródła, podczas gdy bakterii Korarchaeota są najmniej znane, i mimo, że ich DNA zostało poznane, żaden mikroorganizm dotychczas nie został wyizolowany. Pierwotnie sądzono że archaeabakterie były po prostu mieszkańcami ciężkich i najbardziej wrogich środowisk na Ziemi. Np. termofile mogą rozwijać się w temperaturze wyższej niż 100 ° C, psychrofile natomiast, w temperaturach poniżej -10 ° C, podczas gdy acidofile u i alkalifile odpowiednio zamieszkują w środowiskach niezwykle kwasowych lub alkalicznych. Wreszcie halofile preferuja wysoce słone środowiska. Dzisiaj wiemy, że AOA są obecne w wszystkich biocenozach: na przykład bakterie Crenarchaeota uważane są wszechobecnymi składnikami zooplanktonu.
W 2004 r. odkryto ze morskie Crenarchaeota posiadają pewien szczególny enzym wykazujący zdolności do utlenienia amoniaku. Argumentem przekonującym o słuszności tej był fakt, ze obecność tego enzymu jak i zdolność utleniania amoniaku odkryto u Crenarchaeota, Nitrosopumilus maritimus, bakterii który została odkryta w wodzie akwariowej. N. maritimnas jest chemoautotrofem: odżywia sie wodorowęglanami jako jedynymi źródłami węgla (natomiast węgiel organiczny hamuje jego wzrostu) i konwertuje NH4+ w NO2- (zielona linia na rysunku 4 i rysunek 7). Znaleziono również inne AOA, które posiadają podobną zdolność, i które zakwalifikowano do grupy bakterii utleniające amoniak Dokładne analizy genów u wielu archaeabakterii wykazały różnorodność form np. zamieszkujących skały, wodę i osady. Zostały zidentyfikowane również Archaeabakteria symbiotyczne. Na przykład Cenarchaeum symbosiosum, jest gatunkiem symbiotycznym Crenarchaeota z gąbką. Zaskakujące jest to, że zauważono, że ta archaeabakteria nie jest w stanie produkować hydroksyloaminy w bezpośredniej reakcji (patrz wyżej: Nitryfikacja) wskazujący, że tu utlenianie amoniaku występuje na drodze mechanizmu, który różni się od klasycznej nitryfikacji. Wreszcie najnowsze badania wykazują, że większość Crenarchaeota w nitryfikujące są mikroorganizmami, których obecność jest liczbowo dominująca w oceanie.
Rysunek 4. Rysunek przedstawiający cykl azotu zmodyfikowany pod wpływem niedawno odkrytych reakcji. Pokazano stany utlenienia (wartościowości) azotu
Rysunek 5. Drzewo ewolucji.
DNRA
W ostatnich latach, beztlenowa redukcja azotanów/azotynów, DNRA (skrót dla dissimilatory nitrate/nitrite reduction to ammonium) stała się popularnym kierunkiem badań ekosystemów lądowych i morskich. Odkryto bakterie z gatunków Thioploca i Thiomargarita . Oba rodzaje bakterii są w stanie skoncentrować azotany w ich własnych komórkach jako źródło tlenu dla utleniania związków zawierający siarkę. W ten sposób istnieje możliwość redukcji azotanu do amoniaku przechodzącej przez azotyny jako związek pośredniczący z pominieciem hydroxyloaminy (niebieska linia na rysunku 4 i rysunek 7). Te reakcje, chociaż nadal wymagają zrozumienia, potencjalnie dostarczą azotynów i amoniaku do reakcji ANAMMOX (patrz: pkt kolejny) w osadach beztlenowych.
ANAMMOX: beztlenowe utlenianie amonu
Jak widzieliśmy wcześniej w opisanych etapach nitryfikacji, utlenianie amoniaku jest procesem ściśle tlenowym. W rzeczywistości również widzieliśmy, że możliwe może być utlenianie amoniaku w środowisku nisko tlenowym i beztlenowym (na przykład w osadach) poprzez re-mineralizację azotu organicznego (amonifikacja), i/lub redukcję azotynów (DNRA). Przez wiele uważano, że amoniak jest obojętny w warunkach beztlenowych, co znaczy, bezużyteczny dla organizmów żywych. Problem polega na tym, że nie znaleziono bakterii, które są w stanie metabolizować amoniak w warunkach beztlenowych. Trudnosci generalnie wynikały z przyczyn technicznych. Jednak w 2008 roku, problemy przezwyciężono i niektóre laboratoria byly w stanie wyizolować, zidentyfikować, pielęgnować i opisać niektóre rodzaje bakterii ANAMMOX (skrót od ANaerobic AMMonium OXidation), które są zdolne do utleniania amonu do gazowego azotu (N2) (czerwona linia na rysunku 4 i rysunek 7) za pomocą azotynu, zamiast tlenu.
Pierwsze bakterie, które są wyizolowane w środowisku morskim należą do gatunku Scalindua (Sc. sorokinii) Jednak prowadzone są badania dotyczące obecności innych gatunków takich jak Brocadia i Kuenenia. Wspólną cechą tych bakterii, unikatowych w swojej klasie, jest obecność specjalistycznych organelli komórkowych o nazwie anammoxosoma , które są otoczony przez pewne lipidy (tłuszcze), zawierający pewien enzym (reduktaza tlenku hydrazyny), który powoduje ze azotyny i amoniak reagują ze sobą (rysunek 6). Jest to bardzo złożony mechanizm. Jednak następująca reakcja, która jest mocno uogólniona, może pomóc zrozumieć podstawową ideę procesu ANAMMOX.
NH4+ + NO20 = N2 + 2 H2O
Ta reakcja została zbadana po raz pierwszy w próbkach osadów pobranych z różnych ekosystemów morskich (na przykład Morza Czarnego). Zauważono, że w warunkach laboratoryjnych, proces ANAMMOX był odpowiedzialny za utratę 30-50% azotu nieorganicznego z wody morskiej (w postaci N2), sprowadzając go do podobnego poziomu poziomie jak w klasycznej denitryfikacji. Jednak, jeśli przyjrzymy się bliżej, połączone procesy DNRA i ANAMMOX, stwierdzimy, że jest to proces denitryfikacji w warunkach beztlenowych, wyraźnie odmienny od tradycyjnego pojmowania cyklu azotowego. W rzeczywistości DNRA dostarcza azotynów i amoniaku, a ANAMMOX przekształca wszystko do gazowego azotu. Czysta denitryfikacja, mimo, ze zachodzi dzięki odmiennym mechanizmom i szczepom bakterii, ale jednak denitryfikacja.
Rysunek 6. ANAMMOX w komórce bakterii
Obecnie pytanie brzmi: Czy w warunkach analogicznych, procesy DNRA i ANAMMOX występują w akwarium? Nie ma jeszcze dokładnych badań na ten temat, jednak przyjujac pewne założenia możemy znaleźć wyraźne podobieństwa. Dobrze prowadzone DSB moża odtworzyć optymalne warunki dla tego procesu. W rzeczywistości bąbelki azotu N2 są widoczne w głębokich warstwach złoża DSB. Potwierdzają to badania laboratoryjne, które wykazały, ze im głębsza warstwa osadu DSB, tym bardziej beztlenowe warunki otrzymujemy i tym szybsze jest tempo reakcji. Wysoka wydajność metody DSB w usuwaniu azotanów może być spowodowana tym, że zachodzi tam denitryfikacja według klasycznego pojmowania cyklu azotowego jak i tego w warunkach beztlenowych. Oczywiście konieczna jest obecność mocno wyspecjalizowanych szczepów bakterii o których pisałem wyżej. Rysunek 7 przedstawia schemat zintegrowanego cyklu azotu w świetle współczesnych badań
Rysunek 7. Poprawiony i zintegrowany cykl azotu. Wyraźnie zaznaczono strefy zachodzenia poszczególnych reakcji
Podsumowując, obecne badania wyjaśniają wiele niezrozumiałych i niejasnych punktów cyklu azotowego, jednocześnie otwierają nowe horyzonty i pomagają odkrywać procesy, które są jeszcze bardziej złożone. Mam nadzieję, że ten post ułatwi zrozumienia złożoności procesów chemicznych związanych z cyklem azotowym . Mam nadzieję, że z czasem, wiedza ta będzie mogła być stosowana i zintegrowana z akwarium, pomimo rzadkich badań naukowych w tej dziedzinie. Jednakże nawet, jeśli tylko teoretyczne, wiedza ta pozwala nam lepiej zrozumieć, procesy, które mogą wystąpić w naszych zbiornikach i pielęgnować naszą pasję - akwarium.
